我是梅干啊
与传统多色流式实验一样，质谱流式同样需要「烧脑」考虑配色（panel design），在实验前「步步精心」，正所谓一步错，步步错，策划周全的实验方案是获得有效数据的关键。下面就让我们一起揭秘质谱流式，文末更有CyTOF / Luminex 多重检测技术交流会，现场体会质谱流式的魅力。
了解更多质谱流式原理，请查看：质谱流式，一个富二代的自白
特色同位素标记
质谱流式相对于传统流式技术的主要差异在于使用金属元素及其同位素作为抗体标签，目前用作标签的主要有稀土元素、惰性元素、后过渡金属和卤素，这些元素在细胞内含量少，不会引起高背景，也不会影响细胞正常的生理功能，目前用作质谱流式标签的主要同位素如下图所示：
通过这些标签标记的抗体，可以检测细胞相关生物标志物的表达及修饰、细胞活性、细胞功能及细胞周期等。
相较传统流式而言，质谱流式技术中相邻通道的干扰已经降低了很多，然而溢漏现象依然存在，主要由以下几个原因导致：
①.同位素纯度不够（Impurities）。
②. M ± 1，是指相邻通道的溢漏，被称为丰度灵敏度（Abundance Sensitivity），简单说就是质量为M的峰的拖尾，在M + 1和M – 1质量上的信号干扰。
③. M + 16，是指同位素氧化导致的干扰（Oxidation）。如轻镧系元素（139～160 AMU）因为氧化物的形成，导致了对重镧系元素（155~176 AMU）通道产生干扰，目前通过实验体系的优化，最容易氧化的镧系元素同位素的干扰降低到3.0%以下。89Y,102Pd,104Pd,105Pd,106Pd,108Pd,110Pd,113In,115In,和209Bi同位素不会产生氧化干扰，也不会对轻、重镧系元素产生氧化干扰。
（A）质谱流式技术干扰信号源示意图[1]
Chevrier S 等使用单染微球计算出通道间溢漏的矩阵，可作为通道选择的参考，如图B 所示：
（B）基于单染微珠计算的溢漏矩阵。对角线上的值是1。默认情况下，溢漏只计算潜在受影响的通道，包括M ± 1，对应已知同位素纯度，M + 16。小格中的数字表示行中的元素溢漏到列中通道的百分比。最后一列中的数字表示在相应通道中接收到的溢漏信号总量。
Panel Design 基本策略
同传统流式一样，针对不同表达丰度的标志物，也遵循「强弱搭配」原则，即表达丰度高的标志物选择较低或中等灵敏度的同位素标签；表达丰度低的标志物选择高灵敏度的同位素标签。
表达丰度低或未知的抗原：
表达丰度高的抗原：
此外，还可以遵循以下规则：
①. 互斥抗原（如CD4 和CD8）可以安排在有干扰的通道。
②.共表达抗原（如CD3和CD4）安排在互不干扰的通道。如果无法避免，可以安排下级（如CD4）影响上级通道（如CD3）。
③.设置完善的对照。除实验必需对照外，可以设置Mass-minus-one (MMO) controls，类似传统流式的FMO（荧光减一对照），以此判断通道的干扰。
④.区分单细胞群和活细胞群。质谱流式仪无FSC / SSC参数来区分细胞，因此常使用铱（iridium）或铑（rhodium）的同位素作为核酸嵌入剂，根据DNA含量来识别整体细胞群、区分粘连体和碎片。化学治疗剂顺铂（铂）能够和有损伤的细胞膜共价结合，常被用来区分死活细胞。
技术大咖面对面
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文章来源：Bio-Techne 图片来源：Bio-Techne、站酷海洛 题图来源：站酷海洛 Image byGerd AltmannfromPixabay
juan娟娟123
人类的衰老是一个复杂的生理过程，伴随着衰老相关性疾病的发生，譬如癌症、II型糖尿病、自身免疫性疾病、感染、心脑血管疾病等，其主要发病因素之一是免疫衰退。免疫系统的衰退削弱了机体对肿瘤和病原体的抵抗力，同时增加了自身免疫的风险而引起慢性炎症状态。 利用CyTOF技术解析衰老相关的免疫学机制，可为衰老相关性疾病的预防和治疗提供精准方案。 人类衰老相关的外周血免疫细胞的单细胞图谱（IF=14.87） 自然衰老过程中免疫学变化通常表现为多种免疫细胞组成的改变和免疫功能下降。然而目前人们 对血液免疫细胞与年龄相关的变化尚缺乏对全面系统的认识 。2020年， 中山大学中山眼科中心苏文如教授团队 等研究人员 通过CyTOF技术等首次建立人类衰老相关的外周血免疫细胞的高通量单细胞图谱，并系统阐述了衰老相关血液中免疫细胞的表型。 发现随着年龄的增长，血液免疫细胞图谱发生了改变，其特征是T细胞从幼稚和记忆细胞向效应性、细胞毒性、耗竭性和调节性细胞转化，晚期NK细胞、炎性单核细胞以及年龄相关的B细胞增加。研究还揭示了与年龄相关的 DC 的免疫学特征，衰老抑制了 DC 的抗原提呈能力，并上调了 DC 中炎症和衰老相关基因的表达。这一研究成果拓展了人们对衰老免疫学基础的认识[1]。 炎性衰老的保守标志（IF=31.75） 在衰老的生物体中，没有病原体且低水平的全身性炎症是免疫衰老的标志，通常被称为“炎性衰老”。炎性衰老的特征是促炎因子和抗炎因子的不平衡，这极大地预示着死亡和慢性疾病风险。 华盛顿大学药学院 的研究人员使用scRNA、scATAC、 CyTOF 和FACS， 在多个小鼠器官的免疫细胞中表征了与年龄相关的免疫变化。 研究人员定义了器官特异性和常见的免疫分型，并 确定了与年龄相关并表达颗粒酶K（GZMK）的CD8+T（Aging-Associated T Cell，Taa）细胞亚群 。不同于T效应记忆（Tem）细胞，Taa细胞是高度克隆的，具有特定的表观遗传学和转录特征，可响应衰老的宿主环境而发育，并表达耗竭和组织归巢的标志。活化的Taa细胞是GZMK的主要来源，而GZMK则增强了非免疫细胞的炎症功能。在人类中，健康的衰老过程中循环GZMK+CD8+T细胞群的比例会增加，这些细胞与小鼠Taa细胞具有相似转录和表观遗传学特征。 这些结果确定了GZMK+Taa细胞是解决免疫系统与年龄相关功能障碍的潜在靶标 [2] 。 衰老的免疫细胞或可作为抗衰新靶点（IF=49.96） 为了明确免疫系统老化对机体老化的影响，2021年， 美国明尼苏达大学 的研究人员通过基因敲除构建免疫衰老小鼠模型， 随后通过CyTOF技术分析小鼠哪些免疫细胞亚群是衰老的 ， 发现基因敲除小鼠的特异性免疫细胞群损耗和衰老相较于野生小鼠更为严重，基因敲除小鼠的先天性和适应性免疫功能皆受损。 多处组织中的细胞衰老标志物在老年敲除小鼠中表达有所增加，但在年轻敲除小鼠表达却不明显，表明免疫衰老优先于外周衰老。此外，敲除小鼠的非淋巴器官也显示出衰老和损伤的增加，这表明衰老的免疫细胞可以促进全身性衰老。将敲除小鼠或老年野生型小鼠的脾细胞移植到年轻小鼠之后，也会加速后者的衰老。最后研究人员还使用雷帕霉素治疗基因敲除小鼠，发现经过治疗后的基因敲除小鼠的衰老表型得到明显好转，进一步证实了衰老的免疫细胞对全身性衰老的促进作用。研究人员认为 衰老的免疫细胞是衰老细胞中最危险的一种细胞类型，会加速实体器官衰老，从而促进全身衰老。因此，衰老的免疫细胞也成为延缓衰老的关键靶标 [3]。 免疫与衰老的研究正如火如荼的发展， 免疫系统作为研究衰老的细胞和分子变化的基础 已受到越来越多研究人员的重视。 通过免疫细胞延缓衰老的进程和疾病的发生 ，在国内外的应用中逐渐得到肯定。 利用CyTOF 技术对衰老相关的免疫细胞进行系统性的分析，破译衰老个体的单细胞免疫图谱，为阐明免疫系统随衰老环境调控的关键功能通路和免疫机制提供新的研究方向。 Reference： [1] Zheng Y, Liu X, Le W, et al. A human circulating immune cell landscapein aging and COVID-19. Protein Cell. 2020 [2]Mogilenko DA, Shpynov O, Andhey PS, et al. Comprehensive Profiling of anAging Immune System Reveals Clonal GZMK+ CD8+ T Cells as Conserved Hallmark ofInflammaging. Immunity. 2021 [3]Yousefzadeh MJ, Flores RR, Zhu Y, et al. An aged immune system drivessenescence and ageing of solid organs. Nature. 2021
