质粒载体的英文

前面我们讲了拿到一个质粒后对它做快速的基本了解，接下来重点部分就是如何快速阅读质粒图谱。                                                 质粒的命名 拿到一个质粒，第一眼看到的肯定是它的名字，那质粒是怎么命名的？     最初发现的质粒均有研究者根据其表型，大小特征命名，如F因子(fertility factor，致育因子)，R质粒(resistance factor)等。后来提出了一个比较规范的命名规则。 质粒命名规则 1. 第一个字母一律用小写p表示 2. 后面两个字母应该大写，可以采用发现者人名，实验室名称，表型形状或其他特征的英文缩写 例如：UC----University of California BR----Bolivar and Rodrigue 3 编号为阿拉伯数字，用于区分同一类型的质粒 后续比较复杂的质粒命名都是对Vector base质粒按照自身需求改造后进行重新命名。 如下图的质粒 pLV-puro-N-Flag-Snrnp40pLV+抗性puro基因+N端FLG标签+插入基因snrnp40 基本上复杂命名的组成为 p(骨架载体)+启动子/标签+(物种缩写)插入基因+筛选标签+抗性基因+过表达/敲除 下面是常见的骨架载体缩写： RP: Regular plasmid，常规质粒载体 LV: Lentivirus，慢病毒载体 MMLV: MMLV retrovirus，MMLV逆转录病毒载体 AV: Adenovirus，腺病毒载体 AAV: Adeno-associated virus，腺相关病毒载体 Tol2: Tol2 transposon，Tol2转座子 ET, BAD or CS：各种细菌蛋白表达载体 SC: Saccharomyces cerevisiae，酿酒酵母蛋白表达载体 BV: Baculovirus，昆虫杆状病毒蛋白表达载体 插入基因物种人(human),小鼠(mouse),大鼠(rat)分别对应缩写字 母“h”、“m”、“r”以及其他的一些物种等，都是类似的     经过上面的介绍，大部分质粒你拿到之后就能对其想表达的组成有个大概的了解，下面就是质粒图谱的介绍 质粒的寄主范围是由ori区决定的                                                       复制起点     复制起点(ori)：控制复制的起始位点，是基因组上复制起始的一段序列，是由起始复制子(复制子：在质粒DNA中能进行自主复制并维持正常拷贝数的一段最小的DNA序列。)及其调控元件组成。ori富含A-T，氢键少，便于打开进行复制。 复制起点影响着质粒的拷贝数，尤其是复制子的类型决定复制质粒拷贝数。所以复制起点与前面讲的严紧型和松弛型质粒有密切的联系。常见的复制子有pMB1 ，ColE1等(具体的其他可以自行在addgenen上进行了解，顺便帮助自己熟悉addgene这个很重要的网站：http://www.addgene.org/)。如下图的pUC系列和pBRR系列都是pMB1复制子，但是质粒图谱上是看不出来的，基本上做个了解即可，自己做到心里有数质粒是什么类型的，拷贝数多少，防止质粒浓度达不到要求。     复制起点还有一个比较重要的点就是穿梭质粒。一个质粒上有两个复制起点，为了使质粒可以在不同类型宿主中存活和复制。上面的都是一个ori复制点，下面的一个质粒有两个ori复制起点，需要仔细找才能发现另外一个。 一个比较明显是ori，有的图谱上会标ori(-)表示革兰氏阴性菌；还有一个圈住的也是一个复制起点，是能repF，金黄色葡萄菌中一种复制子。 最后一个小点是f1 ori 是控制质粒在f1噬菌体中复制的复制起点，形成ssDNA(single strain DNA 单链DNA)。 欢迎关注小乔爱科研公众号进行探讨和指正，谢谢！

cosmid是英文cossite-carryingplasmid的缩写,也称粘粒、柯斯载体。本意是带有粘性末端位点的质粒,因此,柯斯质粒是人工建造的的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由λ噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及λ噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。柯斯质粒的构建一般都是利用质粒的复制子、选择标记,加上λ的cos位点序列及与包装有关的序列，构建的科斯质粒可以很好地用于基因克隆。早期构建的科斯质粒载体有一些不足，如克隆位点较少，抗性标记单一，容栽能力不大，后来进行了一些改进，克服了这些不足。噬粒(phagemid或phasmid)是由质粒载体和单链噬菌体载体构建成的。它们既有质粒的复制起点，又有噬菌体的复制起点。因此，在大肠杆菌细胞里，可以按正常的双链质粒分子进行复制，生成双链DNA；当存在辅助噬菌体的条件时，在噬菌体基因Ⅱ蛋白质的作用下，又可像单链噬菌体M13一样按滚环模型复制出单链DNA，并在包装成噬菌体颗粒后释放出宿主细胞。最为常用的噬粒载体有pUC118和pUCll9。两者除了多克隆位点的序列正好相反外，其余的序列都是相同的，它们可在宿主细菌内像质粒一样地复制。当宿主细胞受到辅助噬菌体感染后，噬菌体载体便按单链噬菌体的方式进行复制，然后由辅助噬菌体提供的外壳蛋白包装成噬菌体颗粒。辅助噬菌体是一类自身DNA复制效率极低的突变型，但可为宿主细胞的质粒DNA提供的复制和包装所需的蛋白酶和外壳蛋白。

特殊用途载体

载体（Vectors）DNA：1）独立的一个包括启动子（promoter)、编码区（encoding region)和终止子（terminator)的基因，or 组成基因的某个元件，一般是不可以进入受体细胞的；2）采用理化方法进入细胞后，也不容易在受体细胞内维持。所以，通过不同途径能将承载的外源DNA片段带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子称为基因工程载体。

载体（Vectors）定义：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。

多克隆位点(multiple cloning site)ori复制起始点遗传标记pUCMCSAmpr运送外源基因高效转入受体细胞2、为外源基因提供复制能力或整合能力3、为外源基因的扩增或表达提供条件

载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件

目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持高效表达，在很大程度上决定于载体。

基因工程对载体的要求（1）在宿主细胞内能独立复制，ori。（2）有选择性标记Ampr、Tetr、Kanr等。

（3）多克隆位点：外源基因插入的单一限制酶位点。（4）分子量小，可容纳较大的外源基因片段。（5）拷贝数多，方便外源基因在细胞内大量扩增。外源DNA插入其中不影响载体的复制且切点是单一的，这样可将多个外源DNA 片段插入其中。避免基因的非控制性扩散。（6）具有对受体细胞的可转移性。（7）具有较好的安全性，不能任意转移。

大肠杆菌质粒载体pBR322结构图克隆位点克隆位点遗传标记基因复制起点

载体的种类按功能分类克隆载体克隆一个基因或DNA片断表达载体用于一个基因的蛋白表达整合载体把一个基因插入到染色体组中

表达载体用于一个基因的蛋白表达整合载体把一个基因插入到染色体组中按来源分类质粒载体噬菌体载体柯斯质粒载体人工染色体载体00

载体的种类和特征质粒*   受体细胞结构插入片断举例E.coli   环状＜8kb pUC18/19 , T-载体等λ噬菌体线状

EMBL系列，λ gt系列丝状噬菌体及噬菌粒＜10 kbM13mp系列粘粒载体35- 45kbpJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCVBAC (Bacterial Artificial Chromosome)≈300 kbPel oBAC系列YAC (Yeast Artificial chromosome )酵母细胞线性染色体kbMAC (Mammalian Artificial Chromosome)哺乳类细胞＞1000 kb病毒载体动物细胞SV40 载体，昆虫杆状病毒载体穿梭载体和细菌pSVK3质粒，PBV, Ti质粒

第一节克隆载体1.   质粒载体（plasimid vectors）2.   噬菌体载体（phage vectors）

第一节克隆载体1. 质粒载体（plasimid vectors）2. 噬菌体载体（phage vectors）3. 柯斯质粒载体（cosmid vectors）4. 人工染色体载体（B/Y/HAC）

质粒的生物学特性（1）质粒的概念的裸露的环状双链DNA分子，比病毒更简单。

质粒是一种广泛从在于细菌细胞中染色体以外的能自主的复制的裸露的环状双链DNA分子，比病毒更简单。并不是寄主生长所必需的，但可以赋予寄主某些抵御外界环境因素不利影响的能力（带有抗性基因等）。

（2）质粒的大小差异很大，最小的只有1kb,只能编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的达到200kb。质粒的生存在寄主细胞中“友好”地“借居”，它可以赋予寄主一些非染色体控制的遗传性状，以利于寄主的生存。比如，对抗菌素的抗性，对重金属的抗性等。（3）质粒的生存

严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid）(拷贝数少，为1-5个)

（4）质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid）(拷贝数少，为1-5个)松弛型复制控制的质粒（relaxed）(拷贝数多，可达10-200个拷贝)因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。

（5）质粒的不相容性两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。具有不相容性的质粒组成的群体称为不相容群，一般具有相同的复制子。

（6）质粒的可转移性在天然条件下，很多天然质粒都可通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内，这种转移依赖于质粒上的tra基因产物。Conjugative plasmid 接合型质粒（自我转移的质粒）：质粒可从一个细胞自发转移到另一个细胞。Non Conjugative plasmid 非接合型质粒（不能自我转移的质粒）：由于失去控制细菌配对和自我转移的基因，质粒不能从一个细胞自发的转移到另一个细胞。基因工程一般只能利用非接接合型质粒，保证分子操作过程中质粒在细胞中的稳定性。

Tra protein from conjugative plasmid

bom siteMob genemob mRNAMob proteinopenrecipient cellhelper plasmid即mob基因的产物可打开非接合质粒的bom 位点(oriT位点)，借助接合质粒tra基因的产物，使非接合质粒被动迁移到受体细胞中，这种现象称为迁移作用(mobilization)。

质粒DNA的tra基因E.Coli产生菌毛宿主与受体细胞结合遗传物在细胞之间转移（指令）（迁移）大肠杆菌接合（conjunction）

（7）携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义

遗传标记基因定义:在基因工程中使用与选择重组体DNA转化细胞的基因1. 指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞2. 指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子标记基因的作用

标记基因的种类1.   抗性标记基因（可直接用于选择转化子）

a. 抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Cmr，Kanr，G418r，Hygr ，Neorb. 重金属抗性基因: Cur ，Znr ，Cdrc. 代谢抗性基因: TK，抗除草剂基因2. 营养标记基因（可直接用于选择转化子）主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因，这类基因在酵母转化中使用最频繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。3. 生化标记基因其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ，GUS，CAT4. 噬菌斑

1.四环素抗性基因（Tcr）Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。2.氨苄青霉素抗性基因（Apr）Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β-内酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活。3. 氯霉素抗性基因（Cmr）Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。4. 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。来自转座子Tn5和Tn903的Kanr抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。20

质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种。

（8）质粒的存在形式质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种。双螺旋共价闭合环（超螺旋）线状双螺旋（两个裂口）开环双螺旋（一个裂口）

质粒空间构型与电泳速率同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。OC L SC

天然质粒的局限性天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。

质粒载体的命名原则人工组建的质粒人工组建的质粒的第一个字母是质粒英文名字（plasmid）的第一个字符p，用小写。p后有2个字母是大写，表示质粒的作者和实验室名称，再其后为质粒的编号。如pBR322，字母p代表质粒，BR是构建该质粒的研究人员的姓名，322代表…构建的一系质粒的编号。

质粒载体的发展概况第一阶段（1977年前）天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, ColE1, pCR, pBR313和pBR322。第二阶段增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。第三阶段完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。

质粒载体的构建质粒构建基本策略1.加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于选择转化体2.增加或减少合适的酶切位点，便于重组

3.缩短长度，提高导入效率，增加装载量4.改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝5.根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件

1、选择合适的出发质粒: Ori、选择标记、MCS

质粒构建原则1、选择合适的出发质粒: Ori、选择标记、MCS2、正确获得构建质粒载体的元件：酶切、PCR3、组装合适的选择标记基因4、选择合适的启动子5、提高外源DNA的容量灭活一些有害基因，比如与质粒移动有关的基因，或影响质粒复制的负调控基因等。6、需要灭活初始质粒上的某些编码基因7、达到预期目的前提下，构建过程应力求简单

质粒载体：作为基因工程载体，质粒至少应该具备复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点等部分。

质粒载体的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：高拷贝质粒突变拷贝数控制基因拷贝数1000-3000   扩增基因

高拷贝质粒突变拷贝数控制基因拷贝数 扩增基因低拷贝质粒来自pSC101 拷贝数小于10 表达某些毒性基因温敏质粒在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker整合质粒装有整合促进基因及位点便于外源基因的整合穿梭质粒装有针对两种不同受体的复制子便于基因克隆表达质粒装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒装有报告基因便于启动子等元件的克隆筛选

质粒载体的分类（1）高拷贝数的质粒载体ColE1、pMB1、pMB9   松弛型质粒。具有低分子量、高拷贝数的优点。

具有氯霉素扩增效应：每个细胞的拷贝数1000－3000个！用途：适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。

（2）低拷贝数的质粒载体（3）温控的质粒载体由pSC101派生来的载体。特点是拷贝数低。pLG338、pLG339等

适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的基因。减少蛋白质产物对寄主细胞的毒害。（3）温控的质粒载体一些低拷贝基因是温度敏感型，如pBEU1、pBEU2温度低（<37 oC），拷贝数很少；温度增加（>40 oC），拷贝数很快增加到>1000个。

（4）插入失活型质粒载体如pDF41、pDF42、pBR322。无抗生素抗性抗生素抗性

载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。外源DNA片段插入会导致选择记号基因（如tetr、ampr、cmr等）失活。如pDF41、pDF42、pBR322。外源DNA无抗生素抗性抗生素抗性

质粒载体具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型。只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。

（5）正选择的质粒载体质粒载体具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型。只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。可大大降低需要筛选的转化子的数量，从而减轻实验的工作量，提高了选择的敏感性。通过选择具这种表型特征的转化子，便可大大降低需要筛选的转化子的数量只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型，直接选择转化后的细胞，提高了选择的敏感性。注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。并能在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体特称为表达载体（expression vectors）。一种典型的大肠杆菌表达型质粒载体（图4-11）的主要组成部分，包括大肠杆菌的启动子及操纵全点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。

经典的大肠杆菌质粒载体pSC101质粒载体天然质粒，属严紧型低拷贝质粒。9.09 kb。四环素抗性Tetr。

ColE1天然质粒，属松弛型、高拷贝质粒，6.6Kb。有氯霉素扩增效应，每个细胞拷贝

大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫的基因（immE1）

选择标记大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫的基因（immE1）colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成噬菌斑。•colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成“噬菌斑”。•唯一的克隆位点EcoR I 正好位于这个基因的内部。可以通过插入失活筛选。

③不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因

ceaimmkil结构基因免疫基因溶菌基因②杀死不含有ColE1细菌的原因cea + kil基因产物产生菌对细菌素有自身免疫性大肠杆菌所产生的细菌素称为大肠菌素(colicin),它除作用于某些型别的大肠杆菌外,还能作用于亲缘关系相近的志贺菌、沙门氏菌、克雷伯氏菌和巴氏杆菌等。③不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因imm基因

EcoR I位于E1内部，插入外源DNA导致E1失活，使受体菌不能合成E（ColE1-），但仍表现出对E1免疫型（ImmE1+）。

唯一的克隆位点EcoR IEcoR I位于E1内部，插入外源DNA导致E1失活，使受体菌不能合成E（ColE1-），但仍表现出对E1免疫型（ImmE1+）。Colicin E1外源DNA无Colicin用对外源colicin E1的免疫性和自身不能合成colicin E1作选择，操作非常繁杂。

pBR322：人工构建载体p:质粒；BR：质粒两位主要构建者姓氏的第一个字母；322：实验编号三个亲本质粒：

pSF2124pMB1pSC101三个亲本质粒：pMB1:出发质粒(ColE1)pSF2124: AmprpSC101: Tetr把pBR322用限制性内切酶切去某片段，换上合用的表达组件，就可以构建成工作所需的新载体。4.36kb的环状双链DNA，碱基序列已经全部清楚。许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。可见其原型质粒在使用上有优点。

3个会导致Ampr基因失活9个导致Tetr基因失活氨苄青霉素和四环素抗性24个单一克隆位点。

pBR322的优点①双抗生素抗性选择标记抗生素抗性基因的插入失活效应是检测重组体质粒的有效方法，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞®在Amp或Tet中都死亡。获得重组载体的寄主细胞®在Amp或Tet其中之一中死亡。

不含质粒载体含有空质粒载体含有重组质粒载体AmpAmp＋Tet

pBR322重组克隆的筛选重组克隆的“插入失活”筛选方法pBR322—→插入在Tetr中，基因型为Tets 、Ampr——→在含有氨卞青霉素培养基上可生长，在含有四环素培养基上不生长；pBR322—→插入在Ampr中，基因型为Tetr 、Amps、——→在含有氨卞青霉素培养基上不生长，在含有四环素培养基可生长；而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。这种在一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该基因活性丧失的现象叫插入失活。

②分子小，克隆能力大③高拷贝数④安全⑤具有较多的单一酶切位点（24种）

长度4363bp，易于纯化，可以携带6-8Kb的外源DNA片段。③高拷贝数氯霉素扩增之后，每个细胞可1000~3000copies④安全失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。载体越小越好。>10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。缺失流动基因（mob）。这样，质粒就不会从一个细菌接触转移到⑤具有较多的单一酶切位点（24种）

pBR322的缺点保留了转移蛋白（mob）的作用位点。能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别，如果再有F质粒的参与，就有可能转移！

PBR322的改进①删除mob识别位点（如质粒pBR327、pAT153等）。pAT153：从pBR322上切去HaeII片断，既除去了mob识别位点，又增加质粒的拷贝数。

②改造EcoR I 位点pBR325：使EcoRI 也成为插入失活型位点。在pBR322位点上接入一段来自噬菌体PICm的HaeII酶切片断（带有氯霉素抗性基因cmlr）。cmlr上也带一个EcoRI位点。

pUC系列载体在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19

加入一个在5端带有10个多克隆位点的基因lacZ’

（1）元件来源a .ori来自pBR322质粒的复制起点b.   标记基因（ampr）:pBR322的Ampr基因

Lacz基因编码的半乳糖苷酶是四聚体。Lacz’基因含有lacz基因的前59个密码子，a序列，编码a肽。c. lacz’基因：大肠杆菌lac操纵子DNA区段，编码β-半乳糖苷酶a-肽链，是LacZ氨基端的一个片段.载体用于可编码半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。d. MCS 多克隆位点。

（2）克隆位点具有MCS（多克隆位点）区段：位于lacZ’基因的5’端。10个连续的单一限制酶切位点，但它不破坏该基因功能。

有mcs的存在，lacz’基因仍然能编码a肽。如果外源基因插入此mcs区，该基因失活。

x-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，为生色底物，半乳糖苷酶+ x-gal   蓝色

菌落蓝白选择的原理：IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，乳糖类似物，又称为安慰诱导物，可代替乳糖诱导乳糖操纵子结构基因的表达，即可诱导lacz’所编码的半乳糖苷酶氨基末端片段（α－肽）的合成。x-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，为生色底物，半乳糖苷酶+ x-gal蓝色x－gal水解后呈现蓝色

α-互补：pUC类载体带有lacz’基因，编码半乳糖苷酶氨基端片段（α-肽），此片段与宿主细胞所编码的羧基端半乳糖苷酶实现基因内互补，形成有功能的半乳糖苷酶，称α-互补。

α-互补（α-complementation）α-互补是指lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β -galactosidase ，由1024 个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。大肠杆菌的乳糖lac 操纵子中的lacZ 基因编码β-半乳糖苷酶，如果lacZ 基因发生突变，则不能合成有活性的β-半乳糖苷酶。例如，lacZ△M15 基因是缺失了编码β-半乳糖苷酶中第个氨基酸的lacZ 基因，无酶学活性。对于只编码N-端140 个氨基酸的lacZ 基因（称为lacZ'），其产物也没有酶学活性。但这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复β-半乳糖苷酶的活性，实现基因内互补。

菌落蓝白斑选择的原理：在基因克隆时，细菌在含有IPTG和x－gal的培养基中进行培养。IPTG诱导质粒的lacz’基因产生α-肽，同时诱导细菌产生半乳糖苷酶的羧基端片段。两种片段形成有功能的半乳糖苷酶，从而使x－gal水解，产生蓝色物质，使非重组菌落呈现蓝色。当外源基因插到质粒的多克隆位点后，使lacz’失活，不能表达α-肽，破坏了互补作用，细胞内无有活性半乳糖苷酶，使带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。

互补显色反应

a   具有更小的相对分子质量和更高的拷贝数，平均每个细胞可达500-700个拷贝

PUC载体的优点：a 具有更小的相对分子质量和更高的拷贝数，平均每个细胞可达个拷贝b 具有MCS片段，可把具有两种不同粘性末端的外源DNA片段直接克隆到pUC类载体上。2.6kbc 可以用组织化学方法检测重组体（蓝白斑筛选）.

pGEM载体总长度为2743bp   含有一个氨卞青霉素抗性编码基因和一个lacZ’编码基因

一段含有EcoR I、Sat I、Kpn I、Ava I、Sma I、BamH I、XbaI、Sall、AccI、Hinc I、Pst II、Sph I和Hind II等识别序列的多克隆位点。此序列结构几乎与pUC18克隆载体的完全一样。

pGEM系列与pUC系列之间的主要差别pGEM具有两个来自噬菌体的启动子，即T7启动子和SP6启动子，它们为RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。由于这两个启动子分别位于Lac z’基因中多克隆位点区的两侧，故若在反应体系中加入纯化的识别T7或SP6启动子的RNA聚合酶，便可将已克隆的外源基因在体外转录出相应的mRNA。质粒载体pGEM-3Z和pGEM-4Z在结构上基本相似，两者之间的差别仅仅在于SP6和T7这两个启动子的位置互换、方向相反而已。pGEM 系列与pUC 系列之间的主要差别是，它具有两个来自噬菌体的启动子，即T7 启动子和SP6 启动子，它们为RNA 聚合酶的附着提供特异性识别位点。由于这两个启动子分别位于lacZ‘ 基因中多克隆位点区的两侧，若在反应体系中加入纯化的T7 或SP6 RNA 聚合酶，便可以将已经克隆的外源基因在体外转录出相应的mRNA 。质粒载体pGEM-3Z 和pGEM-4Z 在结构上基本相似，两者之间的差别仅仅在于SP6 和T7 这两个启动子的位置互换、方向相反而已。

pGEM-3Z：多拷贝装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’   装有两个噬菌体的强启动子用于外源基因的高效表达

注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等

穿梭质粒载体这种质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构以及相应的选择性标记基因，因此能在两种不同种属的受体细胞中复制并检测，例如既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体。这类载体既具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因,还有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性状通常穿梭载体在细菌中用于克隆,扩增克隆的基因,在酵母菌中用于基因表达分析.穿梭载体(shuttle vector)是指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。例如既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体.这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因,还有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性状,具有多克隆位点.通常穿梭载体在细菌中用于克隆,扩增克隆的基因,在酵母菌中用于基因表达分析.61

用Taq酶的PCR产物3’端加上了一个A。根据这一特点研制出一种线性质粒，其5’端突出的T，它们之间可以连接，即TA克隆。

When it comes to treating diseases like cancer, modern medicine has an impressive arsenal. And one of its most versatile weapons are Y-shaped proteins called monoclonal antibodies. Our immune systems already produce their own antibodies (plasma cell), they come in billions of variations, each matching a specific target, such as a particular toxin, bacteria or virus. When they bind to their target, they send a signal, this bacterium is now marked for destruction. These naturally- produced antibodies are pretty effective. In the 1970s, scientist figured out how to mass produce them.