病毒载体英语

第二节 λ噬菌体载体 λ噬菌体，一种大肠杆菌双链RNA噬菌体。 λ噬菌体的分子量为 31 ×106dal，是一种中等大小的温和噬菌体。迄今已经定位的λ噬菌体的基因至少有61个，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的活动，我们称这类基因为λ噬菌体的必要基因；另一部分基因，当它们被外源基因取代之后，并不影响噬菌体的生命功能，我们称这类基因为λ噬菌体的非必要的基因。 一．λ噬菌体的分子生物学概述 （1）λ噬菌体基因组的结构 在λ噬菌体线性双链 DNA分子的两端，各有一条由12个核劳酸组成的彼此完全互补的5′单链突出序列，即通常所说的粘性末端。注入到感染寄主细胞内的λ噬菌体的线性DNA分子，会迅速地通过粘性末端之间的互补作用，形成环形双链DNA分子。随后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5′-P和3′-OH基团封闭起来，并进一步超盘旋化。这种由粘性末端结合形成的双链区段称为cos位点（略语cos，系英语cohesive-end site的缩写，即粘性末端位点之意）（图5-5）。 在环化的状态下，λ噬菌体DNA分子的长度为48 502碱基对。 （2）λ噬菌体DNA的复制 在λ噬菌体感染的早期，环形的λ DNA分子按θ形式从双向进行复制。到了感染的晚期，控制滚环复制机理的开关被启动了，合成出了由一系列线性排列的人基因组oxA组成的长多连体分子。 （3）λ噬菌体DNA的整合与删除 λ噬菌体基因组的整合作用，是通过它的附着位点att，同大肠杆菌染色体DNA的局部同源位点之间的重组反应实现的。整合作用需要int基因的表达，它是一种可逆的过程。的复制子，这种过程叫做原噬菌体的删除作用。λ噬菌体的删除，需要噬菌体xis基因和bio基因的协同作用才能实现。 （4）λ噬菌体DNA的转录与转译 在溶菌周期，λ噬菌体DN A的转录是在三个时期，即早期、中期和晚期发生的。大体的情况是，早期基因转录确立起溶菌周期；中期基因转录的结果导致 DNA进行复制和重组；晚期基因的转录最终使DNA被包装为成熟的噬菌体颗粒。 二．λ噬菌体载体的构建及其主要类型 （1）构建λ噬菌体载体的基本原理 构建λ噬菌体载体的基本原理是多余限制位点的删除。 按照这一基本原理构建的λ噬菌体的派生载体，可以归纳成两种不同的类型： 一种是插入型载体（insertion vectors），只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。 另一种是替换型载体（rePlacement vectors），具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的人 DNA区段可以被外源插入的 DNA片段所取代(如图5-6)。 在基因克隆中的二者的用途不尽相同。插入型载体只能承受较小分子量（一般在10kb以内）的外源DNA片段的插入，广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆。而替换型载体则可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，所以适用于克隆高等真核生物的染色体DNA(如图5-7)。 （2）λ噬菌体载体的主要类型 （i）插入型载体 外源的DNA克隆到插入型的λ载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应。插入型的λ载体又可以分为免疫功能失活的（inactivatiort of immunityfunction）和大肠杆菌β-半乳糖苷酶失活的（inactlvatlon of E．coli β-galactosidase）两种亚型。 ①免疫功能失活的插入型载体：在这类插入型载体的基因组中有一段免疫区，其中带有一两种核酸内切限制酶的单切割位点。当外源DNA片段插入到这种位点上时，就会使载体所具有的合成活性阻遏物的功能遭受破坏，而不能进入溶源周期。因此，凡带有外源DNA插入的λ重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源DNA插入的亲本噬菌体就会形成混浊的噬菌斑。 ②β-半乳糖苷酶失活的插入型载体：它们的基因组中含有一个大肠杆菌的lac5区段，其中编码着β半乳糖着酶基因lacZ。由这种载体感染的大肠杆菌lac-指示菌，涂布在补加有IPTG和Xgal的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑。如果外源DNA插入到lac5区段上，阻断了β-半乳糖着酶基因lacZ的编码序列，不能合成β-半乳糖昔酶，只能形成无色的噬菌斑。 （ii）替换型载体 替换型载体又叫做取代型载体（substitution vector），是一类在λ噬菌体基础上改建的、在其中央部分有一个可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。 λNM781便是其中的一个代表。在这个替换型载体中，可取代的EcoRI片段，编码有一个supE基因（大肠杆菌突变体tRNA基因）,由于这种λNM781噬菌体的感染，寄主细胞lacZ基因的琥珀突变更被抑制了，能在乳糖麦康基氏（MacConkey）琼脂培养基上产生出红色的噬菌斑，或是在Xgal琼脂培养基上产生出蓝色的噬菌斑。如果这个具有supE基因的EcoRI片段被外源DNA取代了，那么所形成的重组体噬菌体，在上述这两种指示培养基上都只能产生出无色的噬菌斑。 用替换型载体克隆外源DNA包括三个步骤： 第一，应用适当的核酸内切限制酶消化λ载体，除去基因组中可取代的DNA区段。 第二，将上述所得的人 DNA臂同外源DNA片段连接。 第三，对重组体的λDN A分子进行包装和增殖，以得到有感染性的λ重组噬菌体。 三．λ重组体DNA分子的体外包装 （1）λ重组体DNA分子的转染作用 用λ重组体DNA分子直接感染大肠杆菌，使之侵入寄主细胞内。这种由寄主细胞捕获裸露的噬菌体DNA的过程叫做转染（transfection），它有别于以噬菌体颗粒为媒介的转导（kransduction）。 λDNA的转染作用，是一种低效的过程。即便是使用未经任何基因操作处理的新鲜制备的λ DNA，其典型的转染效率（即每微克λDNA转染产生的噬菌斑数目），也仅为 105～106之间。体外连接的结果，转染效率便下降到了104～103左右。 （2）λDNA的体外包装 λDNA的体外包装作用，在离体条件下，将重组体DNA包入噬菌体等病毒颗粒中的过程，以形成有功能的病毒载体。 根据体外互补作用研究发现，λ噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。头部基因发生了突变的噬菌体只能形成尾部，而尾部基因发生了突变的噬菌体则只能形成头部。将这两种不同突变型的噬菌体的提取物混合起来，便能够在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。这就是噬菌体体外包装所依据的基本原理。（图5-8） （3）λ噬菌体DNA的包装限制问题 λ噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力是有一定限度的。上限不得超过其正常野生型DNA总量的5％左右，而低限又不得少于正常野生型DNA总量的75％。 按野生型λDNA分子长度为 48kb计算，λ噬菌体的包装上限是 51kb。编码必要基因的DNA区段占28kb，因此λ载体克隆外源DNA的理论极限值应是23kb。