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发个实验给你参考参考!!!酵母蔗糖酶的分离纯化和活力测定实验简介:酶的分离制备在酶学以及生物大分子的结构功能研究种具有重要意义。啤酒酵母中蔗糖酶含量丰富。本实验用新鲜啤酒酵母作为原料,通过破碎细胞,热处理,乙醇沉淀,柱层析等步骤提取蔗糖酶。并对其活力进行测定。实验原理蔗糖酶主要存在于酵母中,但工业上通常从酵母中制取。酵母蔗糖酶系胞内酶,提取时细胞破碎或菌体自溶。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、离子交换和凝胶柱层析。以此可得到较高纯度的酶。蔗糖酶催化下蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。用测定生成还原糖(葡萄糖和果糖)的量来测定蔗糖水解的速度,本实验中,蔗糖酶的活力单位指在一定条件下反应5min,每产生l毫克葡萄糖所需酶量。 用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量,比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。 实验操作1. 提取 (1) 准备一个冰浴,将研钵稳妥放入冰浴中。(2) 将10g湿啤酒酵母,和适量(5g)二氧化硅一起放入研钵中。二氧化硅要预先研细。 (3) 缓慢加入预冷的30mL去离子水,每次加2mL左右,边加边研磨,至少用30分钟。以便将蔗糖酶充分转入水相,至酵母细胞大部分研碎,以便将蔗糖酶充分转入水相中。(4) (可选项) 研磨时用显微镜检查研磨的效果。(5) 将混合物转入两个离心管中,平衡后,用高速冷离心机,4℃,10000rpm,离心5min。(6) 用滴管小心地取出水相,转入另一个清洁的离心管中,4℃,10000rpm,离心15min。(7) 将清液转入量筒,量出体积,用广泛pH试纸检查上清液pH,用1mol / L 醋酸将pH调至,称为“粗级分Ⅰ”。留出测定酶活力及蛋白含量,剩余部分转入清洁的离心管中。 2. 热处理和乙醇沉淀(1) 预先将恒温水浴调到50℃,将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中,45℃下保温30分钟,在保温过程中不断轻摇离心管。(2) 取出离心管,于冰浴中迅速冷却,用4℃,10000rpm,离心10min。(3) 将上清液转入小烧杯中,放入冰盐浴(没有水的碎冰撒入少量食盐),逐滴加入等体积预冷至-20℃的95%乙醇,同时轻轻搅拌,共需30分钟,再在冰盐浴中放置10分钟,以沉淀完全。于4℃,10000rpm,离心10min,倾去上清,并滴干,沉淀保存于离心管中,盖上盖子或薄膜封口,然后将其放入冰箱中冷冻保存(称为“级分Ⅱ”)。废弃上清液之前,要用尿糖试纸检查其酶活性(于下一个实验一起做)。3. DEAE纤维素柱层析纯化酶蛋白(1) 离子交换剂的处理称取克DEAE纤维素(DE-32)干粉,加入/L NaOH溶液(约50m1),轻轻搅拌,浸泡至少小时(不超过1小时),用玻璃砂漏斗抽滤,并用去离子水洗至近中性,抽干后,放入小烧杯中,加50mL /L HCl,搅匀,浸泡小时,用去离子水洗至。近中性,再用 mol/L NaOH重复处理一次,用去离子水洗至近中性后,抽干备用(因DEAE纤维素昂贵,用后务必回收)。实际操作时,通常纤维素是已浸泡过并回收的,按“碱一酸”的顺序洗即可,因为酸洗后较容易用水洗至中性。碱洗时因过滤困难,可以先浮选除去细颗粒,抽干后用 mol/L mol/L NaCl溶液处理,然后水洗至中性。(2) 装柱与平衡先将层析柱垂直装好,在烧杯内用 mol/L, Tris-HCl缓冲液洗纤维素几次,用滴管吸取烧杯底部大颗粒的纤维素装柱,然后用此缓冲液洗柱至流出液的pH与缓冲液相同或接近时即可上样。(3) 上样与洗脱上样前先准备好梯度混合器,详见附录TH-500梯度混合器使用说明。 用5mL /L,的Tris-HCl缓冲液充分溶解醇级分Ⅱ(注意玻璃搅棒头必须烧圆,搅拌溶解时不可将离心管划伤),若溶液混浊,则4 000r/min离心除去不溶物。取上清液(即醇级分Ⅱ样品,留待下一个实验测酶活力及蛋白含量),将剩余的上清液小心地加到层析柱上,不要扰动柱床,上样后用约30mL缓冲液洗去柱中未吸附的蛋白质,至A280降到以下,注意从上样开始使用部分收集器收集,每管~/l0min。然后打开梯度混合器,采用30mL,/L,的Tris-HCl缓冲液和30mL含/L浓度NaCl的/L,的Tris-HCl.缓冲液,进行线性梯度洗脱,连续收集洗脱液,控制流速~/10min。测定每管洗脱液的A280光吸收值。(4) 各管洗脱液酶活力的定性测定在点滴板上每一孔内,加一滴/L,的乙酸缓冲液,一滴/L蔗糖和一滴洗脱液,反应5min,在每一孔内同时插入一小条尿糖试纸,10~20min后观察试纸颜色的变化。用“+”号的数目,表示颜色的深浅,即各管酶活力的大小。合并活性最高的2~3管,量出总体积,并将其分成10份,分别倒人10个小试管,用保鲜膜封口,冰冻保存,使用时取出一管,此即“柱级分Ⅲ”。4. 各级分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ蔗糖酶活力用/L,乙酸缓冲液(也可以用pH5~6的去离子水代替)稀释各级分酶液,测出酶活合适的稀释倍数:Ⅰ: 1 000~10 000倍;Ⅱ: 1 000~10 000倍;Ⅲ: 100~1 000倍;以上稀释倍数仅供参考。按“表1”的顺序在试管中加入各试剂,进行测定,为简化操作可取消保鲜膜封口,沸水浴加热改为用90~95℃水浴加热 8-10min,以5min生成的还原糖的毫克数为纵坐标,以试管中lmL反应混合物中的酶浓度(mg蛋白/m1)为横坐标,画出反应速度与酶浓度的关系曲线。表1 各级分I、Ⅱ、Ⅲ蔗糖酶活性测定各管名称 对照 级分Ⅰ 级分Ⅱ 级分Ⅲ 葡萄糖管数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13酶液/mL / / /H2O/mL 乙酸缓冲液 / / /葡萄糖2mmol/L / / / / / / / / / / 蔗糖 / / / 加入蔗糖,立即摇匀开始记时,室温准确反应5min后,立即加1mL NaOH中止反应二硝基水杨酸溶液 mL 用保鲜膜封口,扎眼,沸水浴加热5min,立即用水冷却3分钟。H2O/mL 稀释后酶活力 /原始酶活力 /5. 考马斯亮兰法测定各级分蛋白质含量(1) 蛋白质标准曲线制作取14支试管,分两组按下表平行操作。表2 蛋白质标准曲线制作试管编号/mL 0 1 2 3 4 5 6标准蛋白溶液/mL Tris-HCl缓冲液/mL 考马斯亮兰试剂/mL 摇匀,1h内以0号试管为空白对照,在595nm处比色A595nm (2) 各级分蛋白质含量测定考马斯亮兰G-250在酸性溶液时呈茶棕色,最大吸收峰在465nm。当与蛋白质结合后变成深蓝色,最大吸收峰转至595nm,在10~100μg/mL蛋白质浓度范围内成正比。因此在测定各级分蛋白质含量时应稀释适当倍数,使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值,在标准曲线上查出相当于标准蛋白的量,从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。6. 计算各级分的比活力、纯化倍数及回收率 为了测定和计算下面表3中的各项数据,对各个级分都必须取样,每取一次样,对于下一级分来说会损失一部分量,因而要对下一个级分的体积进行校正,以使回收率的计算不致受到不利的影响。1活力单位(U)=酶在室温,pH=条件下,每分钟水解产生1μmol葡萄糖所需酶量。比活力=活力单位/mg蛋白。表3 各级分的比活力、纯化倍数及回收率级分 记录体积(m1) 校正体积(m1) 蛋白质(mg/m1) 总蛋白(mg) Unit(s/m1) 总活力(U) 比活力(Units/mg) 纯化倍数 回收率 (%)Ⅰ 100Ⅱ Ⅲ 下面表4是对假定的各级分记录体积进行校正计算的方法和结果: 表4 实验记录表级分 记录体积 (m1) 校正体积计算 取样体积(m1) 校正后体积(m1)Ⅰ 15 15 Ⅱ 5 5×(15/) Ⅲ 6 6×(15/)×(5/) 五、 结果在同一张图上画出所有管的酶活力、光吸收值A280的曲线和洗脱梯度线。得出各级分的活力,比活力,提纯倍数以及回收率。六、 注意事项从上样开始收集,可能有两个活性峰,梯度洗脱开始前的第一个峰是未吸附物,本实验取用梯度洗脱开始后洗下来的活性峰。七、 作业1.为什么酶的提取需要低温操作?2.热处理的根据是什么?去除热敏感蛋白。参考文献1.邵雪玲,毛歆,郭一清.生物化学与分子生物学实验指导.武汉:武汉大学出版社,20032.张龙翔.高级生物化学实验选编.北京:高等教育出版社,19893.许培雅,邱乐泉.离子交换柱层析纯化蔗糖酶实验方法改进研究.实验室研究与探索,2002,21(3):82~84 编著者——陈彦,李绍飞
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绿色化学是20世纪末崛起的一门新兴学科,相对于传统化学,它是未来化学化工发展的主要方向之一。下面是我为大家整理的化学综述性论文,供大家参考。
1改革措施
加强课前预习
随着中国高校培养水平的逐步提高,目前在对学生的培养中设置了大量的实验课,每周学生都要进行两到三次的实验课学习,学生对实验课已经不存在太多的新鲜感,再加上不同的实验课基本采取的都是同一模式的教学方法,从而导致学生对实验的积极性普遍不高,实验应付差事。以往在做实验之前,通常是由教师组织安排,介绍实验目的、实验原理和仪器设备;对易出现的问题提出注意事项,对实验中出现的现象提出理论解释,学生按教师的讲解按部就班的重复实验,获取数据,验证规律。使用实验规定的仪器设备,按照规定的实验方法和步骤完成规定的实验内容,然后按规定的格式完成实验报告;这样可以培养严谨、认真、规范的学习态度,有利于学生掌握有机化学实验的操作要领。但也往往会使学生由于缺少独立解决问题的意识,而挫伤学生的创造性和积极性,完全把他们放在了被动接受的位置上,严重地束缚了学生的创新性,缺少创新思想,缺少学习兴趣,导致记忆不牢,认识不深,做实验则只为拿学分,走形式,实验操作过而忘,更不会掌握扎实的基础。学生不经过预习,同样可以根据老师的讲解了解实验内容,能够按老师的讲解完成实验,但这样学生对预习报告就会流于形式,照抄教材,敷衍了事,对实验内容了解不深,从而不能真正掌握实验的知识要点[3]。为改变此现状,采用要求学生提前预习的措施。在上课之前,要求学生先交预习报告,否则不能进行实验。实验预习的具体内容要求明确实验目的和要求、了解反应机理、熟悉各种化学试剂的物理常数、画好装置图、列出实验步骤和注意事项。为了杜绝学生应付差事,只是将教材一字不落的抄袭下来的现象,要求预习报告中的实验步骤部分必须细化成一个个步骤,每个步骤必须有简明扼要的标题,标题下写明该步骤的具体内容。预习报告最后要求学生根据教材的注释和网上查找的资料写出注意事项。在对实验讲解时,设置若干问题,对学生进行提问,检验预习效果,同时对学生起到督促作用。通过这些措施,使得学生不得不认真预习,从而提高学习效果。
培养过硬的基本操作能力
有机化学实验包括许多的基本操作,在某种意义上我们可以说有机化学实验就是由若干个基本操作构成的一个复杂的操作体系。若要使实验达到理想的效果,学生必须具备扎实的基本功,具备过硬的基本操作技能[4]。有机化学实验课一般设置了基本操作实验(如熔点的测定、蒸馏和沸点的测定、分馏、减压蒸馏、水蒸气蒸馏、萃取、重结晶、色谱等)和有机化合物的合成实验(如乙酰乙酸乙酯的制备、肉桂酸的制备、呋喃甲醇和呋喃甲酸的制备、1-溴丁烷的制备、乙醚的制备、苯乙酮的制备、己二酸的制备、苯甲酸乙酯的制备等)。基本操作实验是后续合成实验的基础,也是今后学生从事工作和科研的基础,打好这个基础对学生具有重要意义。在教学过程中,经常出现课程已经进行了大半部分,而学生的基本操作过程依然错误百出的现象。如在做蒸馏时,不知道温度计水银球的正确位置、冷凝管如何选用等种种实验细节问题。这种问题的出现客观上是基础实验操作要注意的细节很多,主观上是学生学习态度不够认真造成的。为使学生打下坚实的基础,掌握基本的实验技能,在基本操作实验的教学中应该注意要求学生在实验报告中划出实验装置图,在画图的过程中,学生会注意仪器意见的连接关系,仪器的选用、温度计的位置等各种细节,从而使实验装置深深的引入脑海。学生实验过程中老师要及时指出学生的实验装置和实验操作存在的问题。
提高平时成绩权重
为督促学生平时认真实验,应提高平时成绩的权重。将平时成绩的比重设置为60%,考试成绩占40%。这样如果学生平时不认真做实验,综合成绩不可能理想。将平时成绩细化为预习报告成绩、实验操作成绩、实验报告成绩和考勤。其中实验操作成绩为主要考察内容,所占比重最大。学生每次的预习报告,实验报告都给与相应的量化成绩,督促学生不断改进自己的报告,养成良好的习惯。而对于学生在操作工程中出现的问题,在指正的同时,要及时给与扣分的处罚,鞭策学生去认真改正错误。这样在学期末评定学生平时成绩的时候有据可依,成绩更加公正:而在以往的评定中,因为没有详细的评分细则和平时量化分数,教师只能根据主观判断给出一个笼统的分数,成绩评定往往不够理性。而期末考试不但要考察学生的动手能力,(如:装置搭建顺序、仪器选用、装置拆卸、仪器保养、实验操作、熟练程度等);还应设置相应的问题对学生进行考核,考核内容主要是有机化学实验的重要知识,包括实验室规则及安全常识,化学仪器的使用和养护方法,基础操作的原理及适用范围等。
开设综合设计性实验
二十一世纪高素质创新人才的要求和社会主义市场经济对人才的需求,确定了化学实验教学的目标和基本要求,要求我们建立起从接受型到培养综合型的教学体系。过去,验证性实验占的比例过大,综合性、设计性实验很少,甚至没有。学生做实验几乎成了“照方抓药”,实验所需的仪器、试剂均已由实验员准备好,并摆在试架上,加什么试剂,先后顺序,甚至加几滴都照书本步骤学生毫无主动性可言,只是机械地操作,定时观察预计现象,记录实验数据,不能动手配制试剂,不能独立动手安装仪器,离开书本实验步骤,就无法下手[5]。因此,有机化学实验有必要对实验内容进行调整,使之适应新形势的需要。为了拓宽基础实验的内容,强化学生的综合能力训练,在实验教学改革中注重加强综合实验。取消一些单独的验证性实验,增加了综合性实验,开设了一些设计性实验。采用综合设计实验的方式,使学生成为实验方案的制定者和实验的完成者,使其成为绝对的主角。具体做法是,教师负责拟定多个实验题目,并分配给每个实验小组,要求各小组到数据库查找文献资料,自行拟定实验方案并完成实验。采用这种方式不但提高了学生学习的积极性,而且培养了学生查阅文献与参考书的能力、综合分析资料设计实验的能力和一定的科研素养。
2结语
通过改革,学生的学习积极性、综合素质、动手能力和创新能力得到了很大的提高。学生普遍认为通过综合设计性实验学到了很多知识,包括资料的获取、实验方案的拟定、数据的处理等。由于设计性实验能够充分发挥学生自己的聪明才智,而不是按部就班的做验证实验,学生表现出了较高的兴趣。科学、合理的考核方法使得学生注重实验课程的每一个环节,其素质得到了全面的发展。
国家、社会、经济的发展需要人才的发展,人才是国家发展的第一要素。《国家中长期人才发展规划纲要(2010-2020年)》指出,我国人才的总体发展目标为:到2020年,培养一支规模宏大、结构完善、布局合理、素质优良的人才队伍,全面确立国家人才竞争优势,实现加入世界人才强国行列的目标,为社会主义现代化建设奠定人才基础,并且强调高技能人才要占技能劳动者比例的28%。研究生教育在高等教育中占有非常大的比重,其培养目标是为现代社会输送高科技人才、高级管理、技术人才和研究型、应用型人才,这就要求高等学校在加强全日制研究生培养质量的同时,针对在职人员开展非全日制专业学位研究生的培养,使培养目标呈多样化的发展态势,形成高素质人才队伍,全面提高创新型科技人才、领军人才、复合型人才的培养比重,加大培养各个重点领域急需紧缺专门人才的力度。我国非全日制专业学位研究生教育制度始于1991年,主要培养对象为相关专业的在职人员,采用“进校不离岗”的方式进行学习,不影响学生平时的正常工作。在职工程硕士研究生来自于生产第一线,一般毕业3年以上,长期的工作实践,积攒了一定的实践经验和解决实际问题的能力,企业对他们赋予了较高的期望值,但他们由于毕业时间较长,基础知识的陈旧率和遗忘率较高,专业理论并不能满足企业发展需要,从而在某种程度上限制企业的发展。我国国有大中型企业的快速发展决定了现代工程技术人员应该是高层次应用型和复合型人才。化学工程领域工程硕士的培养目标主要是为本领域所覆盖范围内的工业企业和工程建设部门、工程设计和研究院所等有关单位培养基础扎实、素质全面、工程实践能力强且具有一定创新能力的应用型、复合型高级工程技术人才和工程管理人才。对在职工程硕士进行工程应用和实践能力的培养,其目的就在于使化学工程领域工程硕士学位获得者能够胜任企业要求,促进企业发展,推进企业技术进步,所以各个高校一方面要强化他们的基础知识、专业理论,另一方面要培养他们的实践、操作能力,实现发现、分析、处理企业现实问题的目的。因此,对于非全日制专业学位研究生的培养,要根据企业实际生产需求来设置教学内容,优化教学方法、手段、途径,因此改变传统的教学模式,结合工业生产实例进行高等分离工程课程改革,具有重要的意义。
一、引进绿色化学和绿色分离工程的概念
绿色化学又称为环境无害化学,是一门从源头上消除污染的化学,即利用高选择性的化学反应,提高反应原子的利用率,达到100%选择性,实现零排放。绿色分离工程指的是分离过程绿色化,主要包括两种途径进行实现:第一,优化传统分离过程,降低甚至消除分离过程对环境的影响;第二,开发和使用新的技术,例如,膜分离技术。分离技术贯穿于整个化工产品生产过程,分离过程绿色化对于未来环境保护和污染治理具有重大意义,是社会现代化可可持续发展的关键性问题之一。分离技术是提高产品竞争力的关键技术,对于降低产品生产成本、提高产品质量等发挥着重要作用。教师要让学生明白经济发展在满足当代社会发展的同时,又不能威胁子孙后代的未来。根据现有发展基础、条件,在不损害地球生态系统的前提下,合理有效地利用和开发有限的资源并产生足够的财富,以满足社会合理的经济需求。绿色分离工程等新型分离技术在高等分离工程课程中的引入,必将引领学科的健康和可持续性发展。
二、改进教学方法
与全日制研究生不同,在职研究生来自于化工企业,一般为单位的技术骨干或相关岗位的管理者,有些甚至已经是高层次的专业人才和项目负责人等,具有一定的实践经验和解决实际问题的能力,他们的学习目的很明确,致力于知识转化,用专业知识解决现实问题。对于在职工程硕士来说,他们既要增加自己的知识积累,更要培养自己应用知识的能力,学习的核心就是提高知识的有用性和实效性。因此,教学内容不能过于理论化,如果课程内容理论性过强,将会给学生的学习带来困难,影响学生的学习效果。另外,教学一定要做到理论与实际相结合,例如,教师通过工程中的实际案例解释相关的原理或者理论,侧重理论与应用的结合。教师还要合理安排教学内容,课程结构要紧凑,做到重点突出、难点明确、层层递进、详细透彻,通过这种方式提高学生思考、处理问题的能力。例如,课堂上使用启发式教学法、现场教学法、案例教学法等多种教学方法,实现对教学内容的诠释;综合运用多媒体、网络平台及模拟仿真系统等多种教学手段,使教学内容形象化,最终实现该课程教学质量及教学效果的根本性提高,使其达到培养专业型人才的综合要求,建成学而有用、学而会用的核心课程。针对该课程的特点,结合高等分离工程课程教学的特性以及教学中存在的问题,应对该课程教学进行一定的改革.
1.优化教学方案、完善多媒体课件。教师要根据目前国内外的新技术、新工艺、新设备的发展,在现有课程体系基础上,适当加入新的教学内容,制定出合理的教学方案。多媒体课件是目前高校授课的必备工具,目前该课程主要采用理论教学方法,没有系统的模拟仿真系统和实践设施,因此为提高授课效果,应对该多媒体课件进行进一步的完善,加入基本原理的动画和实际生产的视频,以保证该课程理论教学与实践的有机结合,提高学生的理解能力。
2.采用研讨式的教学方式。由学生提出本单位现场分离设备中存在的问题,根据所学的理论知识和工作经验,找出解决问题的方法,并在各自的实际生产过程中进行验证。
3.为了使学生能够更好地学习、理解和掌握课程的理论技术和方法,采用AspenPlus、Pro/II等化工流程模拟软件,对化工分离过程进行设计和模拟,建立典型案例库,模拟化工分离的过程、分离过程中物质之间的相互作用以及分离工艺中相关设备的直观演示,开发相关的计算软件以解决分离工程中大量计算的问题。
4.让学生提出工厂实际中分离设备存在的问题,并收集现场数据,进而设计程序,得出计算结果,提高学生处理实际问题的能力和素质。
5.充分利用互联网资源。二十一世纪是信息时代,技术人员需要广泛了解科技发展动态,了解学科的前沿性技术并掌握其发展趋势。在职研究生平时在单位工作,只有节假日才能到学校上课,因此建立师生互助平台和网络信息库势在必行,不仅能加强学生与教师的沟通,还能加强学生与学生的联系。教师在学校将专业的最新信息录入信息库内,为研究生开辟获取信息的渠道,学生将遇到的技术困难提交到平台,教师与同学一起通过讨论和研究,提出解决方案,再用于实际生产进行验证。
三、注重教学环节
教学过程是影响研究生教育质量的关键,同时也是保证研究生教育质量的重要因素。高双林等对影响研究生培养质量的可控因素进行了系统分析,主要包括学科建设、教学环节和管理体系三大部分,其权重系数分别为、、,说明教学环节是研究生教育质量保证体系中的重要部分。在职研究生虽然参加工作一段时间,社会经验和工程经验比较丰富,但是回到学校后,往往会存在些许的陌生和拘谨,尤其是在教室内安静的听老师讲课,往往很难。因此,对于这些学生的授课方式,要以互动交流为主,鼓励学生提出生产中的实际问题,例如石油化工过程中针对硫含量过高的问题,鼓励学生结合自己的工作去查阅文献,以化学法和物理吸附法为基础,设计出脱硫的方案,大家以基本理论为依据进行讨论,提出解决方案,并到相关的企业进行验证。
四、优化教师队伍
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